皮肤科白癜风杂志编委 http://m.39.net/pf/a_5522593.html

点击上方蓝字 　　健康雄性8周龄SPF级ApoE-/-小鼠32只和12只同周龄C57BL/6Cnc小鼠，体质量19～21g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。合格号SCXK（京）-。饲养环境：SPF级，室温22~24℃，相对湿度为50%，12h光/暗循环。

1.2药物与主要试剂

*芪甲苷购自于上海源叶生物科技有限公司，批号-43-4，纯度≥98.0%；丹酚酸B购自于上海源叶生物科技有限公司，批号-25-8，纯度≥98.0%；*芪中药配方颗粒和丹参中药配方颗粒医院。 ［67-56-1，液相色谱质谱联用（LC-MS）级，CNWTechnologies）］，乙腈（75-05-8，LC-MS级，CNWTechnologies）， 铵（-61-8，LC-MS级，CNWTechnologies），氨水（-21-6，LC-MS级，CNWTechnologies），内标

L-2- 丙氨酸（-89-3，纯度≥98%，上海恒柏生物科技有限公司）。

2方法

2.1模型制备及给药

给予32只ApoE-/-小鼠高脂饮食14周建立AS模型，取2只模型小鼠经主动脉根部苏木精-伊红（HE）染色确定造模是否成功，2只同周龄C57BL/6Cnc小鼠作为对照。将造模成功的30只小鼠随机分为*芪甲苷-丹酚酸B组、*芪-丹参组及模型组各10只，以10只同龄C57BL/6Cnc小鼠作为空白组。*芪甲苷-丹酚酸B组给予*芪甲苷4mg/kg+丹酚酸B25mg/kg腹腔注射，*芪-丹参组给予*芪颗粒1.56g/kg+丹参颗粒0.78g/kg（折合生品药量）灌胃，空白组和模型组给予相同体积的生理盐水灌胃。日1次，连续12周。

2.2肝组织样品的采集

上述各组给药12周后，腹腔注射10%水合氯醛0.1mL/10g麻醉。打开胸腹腔充分暴露内脏组织，进行心脏灌洗，剪取肝脏，0.9%冰生理盐水清洗3次，放入无RNA酶冻存管，液氮速冻后-80℃保存。

2.3样本处理

用μL含L-2- 丙氨酸（2μg/mL）的提取液以2∶2∶1的比例（乙腈∶ ∶水，体积比）处理50mg肝组织样品。混合样品后加入钢球，在冰水浴中均化（35Hz）4min（重复2～3次），超声处理5min（重复2次）。将样品在-40℃孵育1h，并在4℃离心（离心半径10cm，0r/m，15min），除去μL上清液，放入EP管中进行真空干燥。样品管用50％乙腈（μL）溶解，并在冰水浴中超声处理10min。在4℃下离心（离心半径10cm，r/m，15min），除去75μL上清液用于LC-MS分析，10μL上清液混合作为质量控制（qualitycontrol，QC）样品。

2.4LC-MS分析条件

采用Agilent（AgilentTechnologies）超高效液相色谱仪（ESI）进行LC-MS分析。目标化合物在WatersACQUITYUPLCBEHAmide（2.1mm×mm，1.7μm）液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为水相，含25mmol/L 铵和25mmol/L氨水，B相为乙腈。采用梯度洗脱：0～0.5min，95%B；0.5～7min，95%～65%B；7～8min，65%～40%B；8～9min，40%B；9～9.1min，40%～95%B；9.1～12min，95%B。流动相流速：0.5mL/min，柱温：30℃，样品盘温度：4℃，进样体积：3μL。数据采用信息依赖采集（IDA）模式进行高分辨质谱数据采集。采集软件（AnalystTF1.7，ABSciex）依据一级质谱数据和预先设定的标准，自动选择离子并采集其二级质谱数据。

2.5数据处理

使用ProteoWizard软件将质谱原始转成“质荷比（mz）”XML格式，再使用“XCMS”做保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作，设最小分数（minfrac）为0.5，临界值（cutoff）设为0.3，同时使用自撰写R程序包和自建二级质谱数据库对峰进行物质鉴定，得到由保留时间-质荷比-峰面积组成的数据矩阵。再对其进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）筛选差异代谢物，卡值标准根据变量投影重要性（VIP）＞1，Student’st检验分析的P0.05候选差异代谢物，检索京都基因与基因组百科全书（KEGG）、MetaboAnalyst4.0数据库进一步分析富集的代谢通路。

2.6统计学分析

采用SPSS21.0统计学软件包进行数据处理，计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用两独立样本t检验，取α=0.05为检验水准。

3结果

3.1AS模型构建评估

HE染色结果显示（图1），对照小鼠主动脉根部管腔光滑，无明显脂质沉积，血管内膜结构完整，血管平滑肌细胞和内皮细胞形态结构正常、排列紧密，弹性纤维排列规则，未见明显异常；AS模型小鼠主动脉管腔明显出现脂质沉积，大量粥样斑块形成，致管腔狭窄，局部可见纤维斑块，内皮细胞排列不完整，出现大量胆固醇结晶，弹性纤维断裂，平滑肌细胞排列紊乱。提示AS模型构建成功。

3.2PCA分析

PCA分析考察正、负离子模式下各组间样本离散程度。如图2A、2C所示，可判断出空白组与模型组的样本完全分离，组内聚合程度好，表明两组样本代谢模式明显不同。*芪甲苷-丹酚酸B组、*芪-丹参组与模型组代谢模式有明显分离趋势，见图2B、2D。

3.3OPLS-DA分析

为进一步寻找各组间差异变量，采用监督性OPLS-DA的数学建模对小鼠肝组织样本重建模型，放大它们之间差异，用以评估造成上述分离的差异变量（图3）。正、负离子模式下结果表明，空白组与模型组之间分离更显著，组内聚类程度好。模型组与*芪甲苷-丹酚酸B组、*芪-丹参组分离显著，组内聚类程度良好。各组置换检验显示该模型无过拟，表明OPLS-DA模型可靠。模型组与空白组小鼠肝脏内源性代谢物存在显著差异，*芪甲苷-丹酚酸B组和*芪-丹参组给药后AS小鼠代谢亦发生显著变化。

3.4回调差异代谢物及其代谢通路

通过VIP＞1和P＜0.05筛选标准获得各组差异代谢物并进行鉴定。以模型组与空白组筛选的差异代谢物为标准，*芪甲苷-丹酚酸B组和*芪-丹参组分别与其进行组间比较获取回调差异代谢物信息（表1），进一步寻找共同回调差异代谢物（图4），结果显示 酸和蛋氨酸是*芪甲苷-丹酚酸B组和*芪-丹参组的共同回调差异代谢物。将经鉴定筛选的各组差异代谢物导入KEGG、MetaboAnalyst4.0获取各组富集的差异代谢通路（图5）。寻找包含共同回调代谢物的代谢通路，结果显示*芪甲苷-丹酚酸B组和*芪-丹参组均富集到三羧酸循环（TCA），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，半胱氨酸和蛋氨酸代谢（表2）。

4讨论

中医认为AS其病在血脉，根在脏腑，有本虚标实之特点，补气活血为基本治疗原则。*芪和丹参作为补气活血常用药对，素有补气活血、祛瘀通络之功效。临床和基础研究证实其防治AS有良好疗效。由于中药及复方成分复杂，靶点多且不明确，其现代化发展受到限制，提取中药有效成分配伍成为目前药物研发主要趋势。*芪甲苷与丹酚酸B为*芪与丹参的重要有效成分，本团队前期实验研究显示，两者配伍明显具有抑制AS小鼠粥样硬化斑块进展与调脂作用。为进一步深入探讨有效成分配伍的抗AS作用，从代谢层面整体分析*芪丹参有效成分配伍与药对配伍的异同性，寻找共同潜在生物标志物及代谢通路进行了本研究。小鼠肝组织代谢组学结果显示，两配伍组在回调差异代谢物和代谢途径中表现一定程度相似性， 酸和蛋氨酸是两配伍组共同回调差异代谢物，主要涉及TCA，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢及半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路。

4.1丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢和TCA

丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢和TCA均由 酸富集得到。作为TCA的中间产物， 酸与肝脏脂肪酸代谢有密切关联。肝脏内脂肪酸经β氧化生成 辅酶A（CoA）， CoA进入TCA后与柠檬酸结合通过一系列酶促反应生成 酸，最终转化生成CO2、H2O及腺苷三 （ATP）。另外， 酸可充当炎症和氧化应激等生物信号，如研究显示其含量升高可造成巨噬细胞中白细胞介素（IL）-1β水平增加及组织活性氧（ROS）水平升高。该通路中还显示天冬氨酸、谷氨酸和α-酮戊二酸含量均较模型组升高。谷氨酸被谷氨酸脱氢酶转化生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸脱氢酶催化生成 酰CoA。再经 酰CoA合成酶催化生成 酸和鸟苷三 （GTP）， 酸经 酸脱氢酶（SDH）催化生成延胡索酸，进入苹果酸-天冬氨酸穿梭参与肝组织和心肌内的生物氧化。共同为机体提供能量和合成生物大分子的原料。本研究显示，模型组 酸含量增加，很大程度提示AS小鼠体内不仅出现能量代谢紊乱，还处于炎症及氧化应激状态，符合现代医学对AS发病机制的认识。两配伍组 酸水平均下调，说明给药后代谢途径可能通过促进TCA中 酸进入苹果酸-天冬氨酸穿梭，进而加快体内生物氧化，为机体提供能量。作为肝脏合成胆固醇直接原料的 CoA在TCA中处于不断消耗状态，这使脂肪酸β氧化增强，同时抑制了胆固醇合成，改善和延缓AS病程。另根据 酸生物信号作用，是否对AS小鼠有抗炎和抗氧化作用还需进一步验证。

4.2半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路

蛋氨酸又称甲硫氨酸，提供活性 ，参与 化反应，如促进磷脂酰 合成。蛋氨酸、 缺乏易导致磷脂酰 合成减少，影响脂蛋白如极低密度脂蛋白（VLDL）合成，使VLDL分泌受阻，造成肝内脂肪从输出障碍，导致肝细胞脂肪变性，脂肪肝形成。如Kikusato等研究显示，蛋氨酸缺乏引起肝内脂肪蓄积，可能归因于肉碱棕榈酰转移酶（CPT）介导的脂肪酸导入线粒体的损伤。蛋氨酸在体内经ATP和甲硫氨酸腺苷基转移酶催化生成S-腺苷甲硫氨酸（SAM），SAM失去腺苷后生成同型半胱氨酸，同型半胱氨酸经一系列酶促反应生成半胱氨酸和α-酮 ，前者生成谷胱甘肽，参与体内抗氧化反应，后者转变为 酰CoA进入TCA。同型半胱氨酸可继续在N5- 叶酸转 酶催化下，接受N5- 叶酸提供的 重新生成蛋氨酸。目前，同型半胱氨酸作为心脑血管疾病发生的危险因子，已成为临床检测指标。本研究中两配伍组较模型组蛋氨酸水平明显回调，呈升高趋势。说明经配伍药物干预后，AS小鼠体内可能通过药物外源增加蛋氨酸含量，或药物促进了同型半胱氨酸向蛋氨酸生成，减少了体内同型半胱氨酸蓄积。即增强体内抗氧化作用，可抑制脂质 化，延缓动脉粥样硬化斑块形成及AS进展。在体内蛋氨酸可通过转硫途径生成半胱氨酸，促进谷胱甘肽合成，参与体内抗氧化反应，抑制AS小鼠脂质 化。另外，蛋氨酸有助于促进磷脂合成，减少肝内脂肪蓄积，参与调控AS小鼠肝脏脂类代谢异常及氧化应激。综上，*芪甲苷与丹酚酸B配伍和*芪-丹参配伍抗AS代谢机制均通过调控TCA，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，参与脂质代谢、炎症及氧化应激，具体机制还需进一步验证。已知各脏腑的能量代谢与正常供血供氧密不可分，“气血充足，脏腑相宜”。当脏腑失去血液及氧气供应，正常生理功能出现障碍，“气散则形亡”“血败则形坏”。各脏腑功能气血充盈，能量代谢随之增强。这极大程度说明 酸和蛋氨酸是*芪丹参有效成分配伍发挥原*芪丹参药对配伍的潜在药效靶点。

5结论

本研究创新性采用非靶标代谢组学技术探讨*芪甲苷与丹酚酸B配伍对AS小鼠肝脏代谢的影响，证实*芪甲苷-丹酚酸B和*芪-丹参均参与调控能量代谢和 酸类代谢，与调脂、抗炎、抗氧化密切相关，可发挥抗AS作用。 酸和蛋氨酸是二者共同发挥抗AS的潜在生物标志物。此为后续深入研究其药效具体机制提供了方向，同时也为中药创新性研发提供理论了支撑。编者按：该文刊载于《山东中医药大学学报》年第3期，查看整期内容


转载请注明地址:http://www.chuanshegana.com/csgxgpw/8844.html